Polyklonaler Ziegen-Antikörper für das Epstein-Barr-Virus

Abstrakt
Alle Gammaherpesviren kodieren für ein Hauptglykoprotein, das homolog zum gp350 des Epstein-Barr-Virus ist. Diese Glykoproteine ​​sind häufig an der Zellbindung beteiligt, und einige stellen Neutralisierungsziele bereit. Die Fähigkeit von Gammaherpesviren zur langfristigen Übertragung von Immunwirten impliziert jedoch, dass die In-vivo-Neutralisierung unvollständig ist. In dieser Studie haben wir das Bovine Herpesvirus 4 (BoHV-4) verwendet, um zu bestimmen, wie sein gp350-Homolog – gp180 – zur Virusreplikation und -neutralisierung beiträgt. Ein Mangel an gp180 hatte keinen Einfluss auf die Etablierung und Aufrechterhaltung der BoHV-4-Latenz, sensibilisierte die Virionen jedoch deutlich für die Neutralisierung durch Immunseren.

Antikörper hatten einen besseren Zugang zu gB, gH und gL auf gp180-defizienten Virionen, einschließlich Neutralisationsepitopen. Gp180 scheint stark O-glykosyliert zu sein, und das Entfernen von O-verknüpften Glykanen aus Virionen sensibilisierte sie auch für eine Neutralisierung. Es schien daher, dass gp180 einen Teil eines Glykanschilds für ansonsten anfällige virale Epitope bereitstellt. Interessanterweise könnte dieser O-Glykan-Schild zur Neutralisierung durch Lektine und kohlenhydratspezifische Antikörper genutzt werden. Die Konservierung von O-Glykosylierungsstellen in allen gp350-Homologen legt nahe, dass dies ein allgemeiner Umgehungsmechanismus ist, der auch ein therapeutisches Ziel darstellen kann.

Einführung

Das Epstein-Barr-Virus (EBV) und das Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) sind DNA-Tumorviren, die Risikofaktoren für das Burkitt-Lymphom, das Hodgkin-Lymphom, das Nasopharynxkarzinom, das Kaposi-Sarkom und die posttransplantierte lymphoproliferative Erkrankung darstellen [1]–[2]. Eine EBV-Infektion wurde auch mit Multipler Sklerose in Verbindung gebracht [3]–[4]. Gesunde Träger scheiden beständig Viren im Speichel aus [5], die naive Personen infizieren [6]–[7], obwohl sie virusspezifischen Antikörpern ausgesetzt waren [8]–[9]. Dieser Mangel an Neutralisierung steht in völligem Gegensatz zu nicht persistierenden Schleimhautinfektionen wie der des Poliovirus [10]–[11] und impliziert, dass Gammaherpesviren spezifische Mechanismen zur Vermeidung von Antikörpern entwickelt haben.

• Neutralisierende Antikörper zielen im Allgemeinen auf Epitope ab, die an der Virionbindung oder Membranfusion beteiligt sind [12]. Das Targeting der Fusionsmaschinerie gB/gH/gL [13]–[16] [17]–[18] scheint durch einen Mangel an guten Targets [19] und eine geringe Immunogenität [20] begrenzt zu sein. Daher haben sich die meisten Studien mit der Bindung befasst.
• Das EBV-gp350 ist ein reichlich vorhandener Bestandteil der Virionhülle, die an CD21 auf B-Zellen bindet [21]–[22] und ein Ziel für Antikörper ist, die eine B-Zell-Infektion neutralisieren [23]. Obwohl EBV, dem gp350 fehlt, für B-Zellen schwach infektiös ist [24]–[25], infiziert es CD21-negative Epithelzellen besser als der Wildtyp [25], und diese können ein primäres Ziel für Virionen darstellen, die in naive Wirte eindringen. Eine Epithelinfektion kann sogar durch gp350-spezifische Antikörper verstärkt werden [26].
• Daher muss die Beziehung zwischen EBV-Übertragung, gp350 und gp350-spezifischen Antikörpern weiter erforscht werden, insbesondere da gp350 ein EBV-Impfstoffkandidat ist [27]–[28].
• Unser Verständnis von EBV und KSHV ist durch ihre engen Artentropismen begrenzt. Verwandte tierische Viren sind daher eine wichtige Informationsquelle. Zwei der am besten etablierten experimentellen Modelle sind das Murid-Herpesvirus 4 (MuHV-4) [29] und das Bovine Herpesvirus 4 (BoHV-4) [30]–[31].
• Ihre Homologe von gp350 sind gp150 in MuHV-4 [32], codiert von M7, und gp180 in BoHV-4 [33], codiert von Bo10. Obwohl diese Proteine ​​in ihrer Sequenz unterschiedlich sind, scheinen sie in ihrer Funktion verwandt zu sein, da sie sowohl an der Bindung an einen zellulären Rezeptor als auch an der Blockierung der Infektion von Zellen beteiligt sind, die diesen Rezeptor nicht exprimieren [25], [32]–[33].
• Es wurde vorgeschlagen, dass die Rezeptorinteraktion jedes Homolog verdrängt, um andere am Eintritt beteiligte Glykoproteine ​​aufzudecken. So könnte ein nicht essentielles Glykoprotein [24], [32]–[33] einige kritische Epitope auf zellfreien Virionen vor der Neutralisierung verbergen.

Bisher wurde die in vivo-Funktion von gp350-Homologen nur mit MuHV-4 untersucht. Überraschenderweise zeigten gp150-defiziente Viren in vivo nur eine vorübergehende Verzögerung bei der lytischen Replikation und etablierten normale Latenzwerte [32]. Gp150 ist das am stärksten immunogene MuHV-4-Glykoprotein und Anti-gp150-Antikörper spielen eine vorherrschende Rolle bei der Förderung einer Fc-Rezeptor-abhängigen Infektion [20]. Während gp150 keine offensichtliche direkte Rolle bei der Zellbindung spielt, zeigt BoHV-4 ohne gp180 ein Bindungsdefizit [33]. Daher kann dieses Protein gp350 und dem KSHV K8.1 ähnlicher sein als gp150. Hier untersuchten wir die Folgen der gp180-Deletion für die BoHV-4-Replikation in vivo und die Neutralisierung. Eine wichtige Funktion von gp180 schien darin zu bestehen, die Bindung von Antikörpern an Virionen zu blockieren, die andernfalls neutralisiert würden.

Ergebnisse

Erzeugung einer Bo10-Nonsense-BoHV-4-Mutante
Wir haben zuvor einen BoHV-4-Stamm beschrieben, bei dem der gesamte Bo10-ORF durch eine eGFP-Expressionskassette ersetzt wurde [33]. Da Expressionskassetten eine In-vivo-Abschwächung verursachen können, haben wir auch ein zweites Bo10-Mutantenvirus erzeugt, bei dem die Bo10-Translation 7 Aminosäuren vor dem Ende der vorhergesagten Signalsequenz durch Stoppcodons ohne eine damit verbundene Deletion beendet wurde (Abbildung 1A). Schließlich wurde ein revertanter Stamm namens Bo10 STOP Rev konstruiert, um die Bo10 STOP-Mutante zu validieren. Die vorhergesagten Molekularstrukturen der rekombinanten Stämme wurden durch EcoRI-Restriktionskartierung und Southern-Blotting (Fig. 1B) und weiter durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Immunoblotting mit einem Anti-Bo10-c15-Kaninchen-Polyserum [33] stellte fest, dass den mutierten Bo10-Virionen gp180 fehlte (Abbildung 1C).
Verbreitung von Bo10-Mutanten in vivo
Um die Bedeutung von Bo10 in vivo zu untersuchen, infizierten wir Kaninchen mit den verschiedenen Virusstämmen, wie in Material und Methoden beschrieben. Kein Kaninchen zeigte bei der Nekropsie 64 Tage nach der Inokulation eine klinische Erkrankung oder erkennbare Pathologie. Die Wirtsbesiedelung wurde durch quantitative PCR von DNA aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) im Laufe der Zeit (Abbildung 2A und B) und aus der Milz 64 Tage nach der Inokulation (Abbildung 2C und D) getestet. Die Bo10-Mutanten zeigten kein Defizit. Wir führten ferner Infektionszentrumsassays an Milzzellen von WT- und Bo10-STOP-infizierten Kaninchen durch. Virale Plaques wurden in allen Proben beobachtet (Abbildung 2E). In den äquivalenten gefrier-aufgetauten Proben wurde kein vorgebildeter infektiöser Virus nachgewiesen (Daten nicht gezeigt), so dass es sich um eine latente Infektion handelte. Daher konnten wir keinen Unterschied in der akuten Replikation, Latenzbildung oder Reaktivierung von Bo10-defizienten Mutanten im Vergleich zu WT- oder revertanten Stämmen feststellen.
Erhöhte Anfälligkeit von Bo10-BoHV-4 gegenüber Serumneutralisation
Während Pathogenese-Assays ein nützliches Maß für die virale Fitness sind, messen sie nicht alle viralen Funktionen. Insbesondere die Virionanfälligkeit für Neutralisierung [33] wird möglicherweise nicht gemessen, da die Verbreitung innerhalb des Wirts hauptsächlich von der Virusausbreitung Zelle/Zelle und der Latenz-assoziierten Zellproliferation abhängt. Wir verglichen daher weiter die Empfindlichkeit von BoHV-4 WT-, Bo10 Del-, Bo10 Rev- und Bo10 STOP-Stämmen gegenüber einer Neutralisation durch Seren von Kaninchen, die mit dem BoHV-4 V.-Teststamm infiziert waren ( 3 ). WT- und Bo10-Rev-Virionen wurden schlecht neutralisiert. Bo10 Del und Bo10 STOP Virionen wurden viel besser neutralisiert. Insbesondere war nun eine vollständige Neutralisation möglich. Neutralisierungsexperimente mit eGFP-exprimierenden Viren auf verschiedenen Zelltypen bestätigten dieses Ergebnis, wobei gp180-defiziente Virionen im Vergleich zu WT-Virionen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Neutralisierung durch Anti-BoHV-4-Serum zeigten (Abbildung S1). Somit schien gp180 die Virion-Neutralisierung zu begrenzen.
Variation der Bo10-Sequenz
Um zu verstehen, wie gp180 das Virion vor Neutralisierung schützen könnte, haben wir die Bo10-Gene verschiedener BoHV-4-Isolate verglichen [34]. Alle zeigten Konsensus-Splice-Donor- und -Akzeptorstellen, die im BoHV-4-V.-Teststamm verwendet werden, um gp180 zu erzeugen [33]. Der Vergleich der Nukleotidsequenzen über die gesamten offenen Leserahmen ergab bis zu 15 % Divergenz zwischen den Stämmen (Tabelle S1). Die Aminosäuredivergenz zwischen amerikanisch-europäischen und afrikanischen Stämmen erreichte 39 %, hauptsächlich in der N-terminalen Hälfte der Protein-Ektodomäne (Abbildung 4A). Im Vergleich dazu unterscheiden sich gB, gH und gL zwischen KSHV-Stämmen um < 2 % [35]; gB unterscheidet sich um <2 % zwischen OHV-2-Stämmen [36]; und ORF71 unterscheidet sich zwischen BoHV-4-Stämmen nur um 5 %. Alle gp180s waren extrem reich an Serin- und Threoninresten, die 54,3 +/– 0,6 % jeder reifen Ektodomäne ausmachten (Abbildung 4A). Asparaginrückstände machten weitere 8,0 +/- 0,6 % aus. Daher schien eine umfangreiche O- und N-verknüpfte Glykosylierung ein konserviertes Merkmal zu sein.
Gp180 ist O-glykosyliert
Das Bo10-Genprodukt von BoHV-4 V.test hat 122 bzw. 7 potenzielle O- und N-Glykosylierungsstellen (Abbildung 4) [37]. Dieses Protein hat eine vorhergesagte Molekülmasse (MM) von 25 kDa, aber eine scheinbare MM von 180 kDa [33]. Um den Beitrag von Glykanen zum scheinbaren MM festzustellen, verdauten wir Virionlysate mit Glykanasen. Wir entfernten mannosereiche, hybride und komplexe N-Glykane [38] mit PNGase F.

Wir entfernten O-Glykane nacheinander mit Sialidase A, β1-4 Galactosidase und O-Glykanase. Während PNGase F die scheinbare MM von gp180 ( 5A ) nicht beeinflusste, reduzierte das Entfernen von O-Glykanen sie auf etwa 20 kDa, was mit ihrer vorhergesagten nicht glykosylierten MM übereinstimmt. Daher wurde gp180 extensiv O-glykosyliert und O-Glykane scheinen für den größten Teil seiner Masse verantwortlich zu sein.