MethylFlash methyliertes DNA-Quantifizierungskit (fluorometrisch)

In diesem Blogbeitrag werden wir untersuchen, wie sich methylierte DNA auf den menschlichen Körper auswirkt und wie ein MethylFlash-Kit verwendet werden kann, um die Menge an methylierter DNA in einer Probe zu messen. Das MethylFlash-Kit ist ein benutzerfreundliches Quantifizierungskit, mit dem die Menge an methylierter DNA in einer Probe gemessen werden kann. Das Protokoll ist unten aufgeführt.

Wie funktioniert es?

Methylierte DNA ist ein DNA-Typ, der durch Hinzufügen einer Methylgruppe modifiziert wurde. Diese Modifikation kann die Funktion der DNA verändern und möglicherweise an der Krebsentstehung beteiligt sein. Methylierte DNA kann mit einer Technik namens Bisulfit-Sequenzierung nachgewiesen werden. Bei dieser Technik wird DNA mit einer Chemikalie namens Bisulfit behandelt, die unmethyliertes Cytosin (C) in Uracil (U) umwandelt. Die methylierten Cs werden durch die Bisulfitbehandlung nicht verändert und verbleiben als C.

Um die DNA-Methylierung nachweisen zu können, muss sie durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert (kopiert) werden. Diese Technik macht sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar. Nach der PCR-Amplifikation wird die DNA der Bisulfitbehandlung unterzogen und mittels Kapillarelektrophorese analysiert. Jeder Peak in einem Kapillarelektrophorese-Ergebnis repräsentiert ein ursprüngliches DNA-Molekül mit einer leicht unterschiedlichen Länge. Proben, die vollständig in Uracil umgewandelt wurden

Warum einen methylierten DNA-Test verwenden?

Methylierte DNA-Tests werden verwendet, um festzustellen, ob eine Person eine bestimmte Genmutation hat oder nicht. Der Test kann verwendet werden, um genetische Störungen, Krebs und andere Erkrankungen zu diagnostizieren. Was ist DNA-Methylierung?

DNA-Methylierung beschreibt die Hinzufügung eines Moleküls namens Methylgruppe an den DNA-Strang. Es kommt natürlicherweise bei Menschen und Tieren vor, insbesondere wenn eine Genmutation vorliegt. Wenn dies geschieht, werden Gene nicht richtig exprimiert und daher „zum Schweigen gebracht“. Das Gen kann normal sein, aber aufgrund von Mutationen in anderen Teilen der Sequenz nicht richtig exprimiert werden. Ein DNA-Methylierungstest bestimmt, ob jemand diese Form der genetischen Mutation hat oder nicht.

Wann werden methylierte DNA-Tests durchgeführt?

Methylierte DNA-Tests werden am häufigsten aus zwei Gründen verwendet: zur Diagnose genetischer Erkrankungen und zur Identifizierung von Krebspatienten, bei denen das Risiko besteht, dass sie nach der Behandlung wieder in Tumore zurückfallen. Genetische Bedingungen, die diagnostiziert werden können

Was sind die Vorteile des Tests auf methylierte DNA?

Methylierte DNA ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das Forschern helfen kann, die Rolle der Epigenetik bei Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Durch Tests auf methylierte DNA können Forscher Gene identifizieren, die durch epigenetische Veränderungen ein- oder ausgeschaltet werden. Diese Informationen können dann verwendet werden, um neue Behandlungen für Krankheiten zu entwickeln, die durch epigenetische Veränderungen verursacht werden.

So funktioniert das MethylFlash Quantification Kit (vollständiger Satz optimierter Puffer und Reagenzien zur fluorometrischen Quantifizierung globaler DNA)

Das MethylFlash-Quantifizierungskit ist ein vollständiger Satz optimierter Puffer und Reagenzien zur fluorometrischen Quantifizierung globaler DNA. Das Kit verwendet eine proprietäre Methode, um nur methylierte DNA selektiv anzuvisieren und zu quantifizieren. Dies stellt sicher, dass die Ergebnisse genau und präzise sind. Darüber hinaus kann die Amplifikation der DNA durch PCR vermieden werden, da nur der methylierte Anteil quantifiziert wird. Das MethylFlash Quantification Kit ist ideal für die globale DNA-Quantifizierung und/oder zur Bestimmung von Änderungen der globalen DNA-Methylierung während einer bestimmten Behandlung oder eines Krankheitsverlaufs. Es kann auch zur Untersuchung einer Vielzahl von Krankheiten im Zusammenhang mit DNA-Methylierung verwendet werden, darunter Krebs und neurodegenerative Erkrankungen (siehe Abbildung „Verwendung des MethylFlash-Quantifizierungskits“). Detailliertes Protokoll von Promega Corp.

Instrumentierung, Probenmaterial und Zeitbedarf (Anforderung für kleinvolumige Proben)

„Finding methylated DNA“ ist eine detaillierte Anleitung zum Auffinden und Identifizieren methylierter DNA mit einer Vielzahl unterschiedlicher Methoden und Techniken. Der Blog-Bereich bietet zusätzliche Informationen über die Art der Instrumentierung, das Probenmaterial und den Zeitbedarf, der benötigt wird, um diesen Prozess erfolgreich durchzuführen.

In Bezug auf die Instrumentierung benötigen diejenigen, die methylierte DNA finden möchten, Zugang zu einem hochwertigen UV-Vis-Spektrophotometer und einem PCR-Gerät. Was das Probenmaterial betrifft, so wird empfohlen, Proben mit kleinem Volumen zu verwenden, um potenzielle Fehler zu vermeiden, die bei größeren Proben auftreten könnten. Schließlich variiert die für die Durchführung dieses Vorgangs erforderliche Zeit je nach verwendeter Methode, aber im Allgemeinen sollte es von Anfang bis Ende nicht mehr als ein paar Stunden dauern.

Methodik oder Protokoll

Methylierte DNA kann mit einer Reihe verschiedener Methoden und Protokolle gefunden werden. Die gebräuchlichste Methode ist die Bisulfit-Umwandlung, bei der DNA mit Bisulfit behandelt wird, um alle unmethylierten Cytosine in Uracile umzuwandeln. Darauf können eine PCR-Amplifikation und Sequenzierung oder ein Restriktionsenzymverdau und Southern-Blotting folgen. Andere Verfahren umfassen Nick-Translation, Immunpräzipitation und direkte Sequenzierung von methylierter DNA.

Assay-Parameter

Methylierte DNA kann schwierig zu detektieren und zu quantifizieren sein. Der beste Ansatz hängt von der Anwendung ab, aber es gibt ein paar Schlüsselparameter zu beachten:

-Extraktionsmethode: Dies ist entscheidend, um gute Ausbeuten an methylierter DNA zu erhalten. Methoden, die für genomische DNA gut funktionieren, sind möglicherweise nicht so effektiv für die Extraktion methylierter DNA.

-Quantifizierungsmethode: Es gibt mehrere Möglichkeiten, methylierte DNA zu quantifizieren, einschließlich PCR, qPCR und Sequenzierung der nächsten Generation. Jedes hat seine eigenen Vor- und Nachteile.

-Assay-Empfindlichkeit: Dies ist bei der Auswahl einer Quantifizierungsmethode zu berücksichtigen. Einige Methoden sind empfindlicher als andere, daher ist es wichtig, eine Methode zu wählen, die Ihnen das erforderliche Maß an Empfindlichkeit bietet.

Interpretation der Ergebnisse

Nachdem Sie Ihre Bisulfit-Umwandlung und -Sequenzierung abgeschlossen haben, ist es an der Zeit, Ihre Ergebnisse zu analysieren, um festzustellen, ob Sie methylierte DNA gefunden haben. Dazu müssen Sie Ihre Bisulfit-konvertierten Reads an einem Referenzgenom ausrichten. Sobald Sie Ihre Reads ausgerichtet haben, können Sie eine Vielzahl von Methoden verwenden, um Methylierung zu nennen.

Eine beliebte Methode, um Methylierung zu nennen, ist MethylDackel. MethylDackel verwendet ein Hidden-Markov-Modell, um den Methylierungsstatus jeder CpG-Site vorherzusagen. MethylDackel kann mit einer einzelnen Probe oder mit mehreren Proben gleichzeitig durchgeführt werden.

Eine weitere beliebte Methode zum Callen von Methylierung ist MethylSig. MethylSig verwendet eine Support-Vektor-Maschine, um den Methylierungsstatus jeder CpG-Stelle vorherzusagen. MethylSig kann auch mit einer einzelnen Probe oder mit mehreren Proben gleichzeitig ausgeführt werden.

Sobald Sie die Methylierung mit einer dieser Methoden aufgerufen haben, müssen Sie Ihre Ergebnisse interpretieren. Als Erstes sollten Sie sich den Gesamtmethylierungsgrad Ihrer Probe (oder Proben) ansehen. Sie können dies berechnen, indem Sie sich den Prozentsatz der CpG-Stellen ansehen, die methyliert sind

Fazit

Es gibt viele Möglichkeiten, methylierte DNA zu finden, aber das Wichtigste ist, eine Methode zu verwenden, die für Ihre Forschungsziele spezifisch ist. Wenn Sie bestimmte methylierte Gene identifizieren müssen, ist die Verwendung einer PCR-basierten Methode möglicherweise am besten. Wenn Sie an globalen Mustern der DNA-Methylierung interessiert sind, ist die Bisulfit-Sequenzierung möglicherweise die bessere Option.