Phosphotyrosin(PY793)-Antikörper

Abstrakt
Fms-ähnliche Tyrosinkinase 3 (Flt3) ist ein wichtiger Wachstumsfaktorrezeptor in der Hämatopoese. Gain-of-Function-Mutationen des Rezeptors tragen zur Transformation der akuten myeloischen Leukämie (AML) bei. Src-like adapter protein (SLAP) ist ein Interaktionspartner der E3-Ubiquitin-Ligase Cbl, die die Rezeptortyrosinkinasen-vermittelte Signaltransduktion regulieren kann. In dieser Studie analysierten wir die Rolle von SLAP bei der Signaltransduktion stromabwärts der Typ-III-Rezeptor-Tyrosinkinase Flt3.

Die Ergebnisse zeigen, dass SLAP nach Ligandenstimulation über mehrere Phosphotyrosinreste in Flt3 stabil mit Flt3 assoziiert. SLAP interagiert konstitutiv mit dem onkogenen Flt3-ITD und kolokalisiert mit Flt3 in der Nähe der Zellmembran. Diese Assoziation initiiert die Ubiquitinierung und den Abbau von Cbl-abhängigen Rezeptoren. Die Depletion der SLAP-Expression durch shRNA in Flt3-transfizierten Ba/F3-Zellen führte zu einer schwächeren Aktivierung der FL-induzierten PI3K-Akt- und MAPK-Signalgebung. Eine Metaanalyse von Microarray-Daten aus Patientenproben legt nahe, dass SLAP-mRNA bei verschiedenen Krebsarten unterschiedlich exprimiert wird und ihre Expression bei Patienten mit der Flt3-ITD-Mutation signifikant erhöht war. Somit deuten unsere Daten auf eine neue Rolle von SLAP bei verschiedenen Krebsarten und bei der Modulation der Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalgebung abgesehen von seiner herkömmlichen Rolle bei der Regulierung der Rezeptorstabilität hin.

Einführung

Die Fms-ähnliche Tyrosinkinase 3 (Flt3) ist eine Typ-III-Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), die zur selben Unterfamilie gehört wie die Rezeptoren des plättchenbasierten Wachstumsfaktors (PDGF), cKit, und der Makrophagenkolonie-stimulierende Faktor (M-CSF). Rezeptor [1]. Wildtyp-Flt3 wird hauptsächlich in hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert und wirkt in der Hämatopoese.

  • Es fördert normalerweise die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen durch die Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) sowie der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Akt-Signalwege. Die Stimulation des Flt3-Rezeptors mit seinem Liganden (FL) führt zur Dimerisierung von Rezeptoren und Aktivierung seiner intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität.
  • Dieses Ereignis initiiert ferner die Phosphorylierung an Tyrosinresten innerhalb der intrazellulären Domäne des Rezeptors sowie an nachgeschalteten Signaltransduktionsmolekülen. Die phosphorylierten Tyrosinreste erleichtern die hochaffine Bindung von Signaltransduktionsmolekülen, die Src-Homologie-2-(SH2)- oder Phosphotyrosin-bindende (PTB)-Domänen enthalten.
  • Das Src-ähnliche Adapterprotein (SLAP) wurde ursprünglich als negativer Regulator der Wachstumsfaktor-Signalübertragung identifiziert [2] und anschließend an der negativen Regulation der T-Zell-Signalübertragung beteiligt [3]. SLAP ist hochgradig homolog mit Kinasen der Src-Familie (SFKs), die Src-Homologie-3-(SH3)- und SH2-Domänen enthalten.
  • Im Gegensatz zu Src fehlt SLAP eine Tyrosinkinase-Domäne und enthält stattdessen einen einzigartigen Carboxy-Terminus. Die T-Zell-Signalgebung wird durch die Assoziation von SLAP mit dem phosphorylierten T-Zell-Rezeptor (TCR) reguliert, was zur Rekrutierung der E3-Ubiquitin-Ligase Cbl zum TCR führt. Dies führte zur Ubiquitinierung und zum Abbau des TCR [4]. Cbl ist eine der am besten untersuchten Ubiquitin-Ligasen, die an der RTK-Signalübertragung beteiligt sind. Loss-of-Function-Mutationen in Cbl wurden bei akuter myeloischer Leukämie (AML) beschrieben und tragen nachweislich zur onkogenen Transformation bei [5].
  • Obwohl SLAP ursprünglich als Regulator der T-Zell-Signalübertragung involviert war, ist es auch an der Regulation der Signalübertragung durch hämatopoetische Zellen beteiligt. SLAP assoziiert auch mit Komponenten des B-Zell-Rezeptor(BCR)-Komplexes und moduliert die nachgeschaltete Signalübertragung durch Cbl-vermittelte Herunterregulierung des Komplexes [6].
  • Etwa 30 % der Patienten mit AML tragen eine Mutation im Flt3-Gen [7]. Mutationen führen zu einer ligandenunabhängigen konstitutiven Aktivierung des Rezeptors. Die häufigste Mutation ist die sogenannte interne Tandemduplikation (ITD) in der Juxtamembranregion des Rezeptors [8].
  • Die ITD-Mutation stört die Funktion, die die Juxtamembranregion des Rezeptors auf der Kinasedomäne darstellt. Andere Mutationen, die eine konstitutive Kinaseaktivität induzieren können, umfassen Punktmutationen in der Nähe von Codon 835 oder 842 innerhalb der Tyrosinkinasedomäne, die sowohl bei pädiatrischer als auch bei erwachsener AML beschrieben wurden [9].

Signale von Flt3 werden durch direkte Assoziation von Signalmolekülen an den aktivierten Rezeptor übertragen. Relaismoleküle, von denen berichtet wird, dass sie rekrutiert werden, umfassen SFKs, SHIP1, SHP2, Cbl, Ras-GAP, PLCγ, Vav, Shc, Grb2 und Stat5 [1]. Diese Signalkaskaden müssen streng reguliert werden, was hauptsächlich durch Ubiquitin-Ligase-vermittelten Rezeptorabbau und durch durch spezifische Protein-Tyrosin-Phosphatasen vermittelte Dephosphorylierung erfolgt. Onkogene Mutationen bei Krebs können zu einer verringerten Ubiquitinierung der Rezeptortyrosinkinasen führen, entweder aufgrund von Mutationen der Bindungsstellen für Ubiquitin-Ligasen in den Rezeptoren selbst oder durch inaktivierende Mutationen in den Ubiquitin-Ligasen [10].

In dieser Studie untersuchen wir die Rolle von SLAP in Flt3-Signalwegen. Wir liefern den Beweis, dass SLAP als Reaktion auf die Ligandenstimulation direkt mit Flt3 assoziiert und die Ubiquitinierung und den Abbau von Rezeptoren in einer Cbl-abhängigen Weise reguliert. Darüber hinaus reduziert der selektive Knockdown von SLAP die FL-induzierte Akt-, Erk- und p38-Aktivierung.

Materialen und Methoden

Reagenzien und Antikörper
Die Transfektionsreagenzien Lipofectamine 2000 und jetPEI waren von Invitrogen bzw. Polyplus-transfection. Cycloheximid war von Sigma. Der Phosphotyrosin-Antikörper 4G10 war von Millipore und der Ubiquitin-Antikörper war von Covance Research Products. Der Flt3-Antikörper wurde bereits beschrieben [11]. Shc-, Phospho-p38- und p38-Antikörper stammten von BD Transduction Laboratories. Phospho-Akt-Antikörper war von Epitomics. Polyklonale Antikörper gegen SLAP, Gab2, Shp2, Akt, Phospho-Erk und Erk wurden von Santa Cruz Biotechnology bezogen. Phycoerythrin (PE)-markierter Flt3-Antikörper war von BD Biosciences. Meerrettichperoxidase-gekoppelte sekundäre Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Antikörper stammten von Invitrogen.

Ausdruckskonstrukte
Die Konstrukte pcDNA3-Flt3-WT, pcDNA3-Flt3-ITD und pMSCV-Flt3-WT wurden zuvor beschrieben [11]. Das pcDNA3-SLAP-FLAG wurde durch Subklonieren des offenen Leserahmens voller Länge von SLAP in den pcDNA3-Vektor konstruiert. Die Flt3-Mutante Flt3-Y589F/Y591F/Y599F wurde durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des QuikChange-Mutagenese-XL-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) erzeugt.

Zellkultur
Ba/F3- und COS-1-Zelllinien wurden von DSMZ (www.dsmz.de) bezogen. Ba/F3-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium kultiviert, das mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 10 ng/ml rekombinantem murinem Interleukin-3 (IL-3) ergänzt war. . COS-1- und EcoPack-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 &mgr;g/ml Streptomycin, gezüchtet.

Transiente Transfektion
COS-1-Zellen wurden mit JetPEI gemäß dem Protokoll des Herstellers transient transfiziert. Den Zellen wurde 24 Stunden nach der Transfektion über Nacht Serum-ausgehungert und dann bei 37°C mit 100 ng/ml FL (Prospec Tany) für die angegebene Zeit stimuliert.

Stabile Transfektion von Ba/F3-Zellen
Verpackung EcoPack-Zellen wurden mit dem pMSCV-Flt3-WT-Konstrukt unter Verwendung von Lipofectamine 2000 transfiziert. Virushaltige Überstände wurden 72 Stunden nach der Transfektion gesammelt. Ba/F3-Zellen wurden dann mit Viruspartikeln infiziert, gefolgt von einer 2-wöchigen Selektion in 1,2 &mgr;g/ml Puromycin. Die Expression von Flt3 wurde durch Durchflusszytometrie bestätigt. Flt3-transfizierte Ba/F3-Zellen wurden dann weiter mit den SLAP-shRNA- und Kontroll-shRNA-Konstrukten durch Elektroporation transfiziert. Die Zellen wurden mit 0,8 mg/ml G-418 für 2 Wochen selektiert und der SLAP-Knockdown wurde durch Western-Blotting untersucht. Ba/F3-Zellen wurden für 4 Stunden in RPMI-1640-Medium ohne Serum und Zytokine Serum-ausgehungert und dann mit 100 ng/ml FL bei 37°C für die angegebene Zeit stimuliert.

Affinitätsfischen von SLAP mit immobilisierten Peptiden
Phosphopeptide, die den Tyrosinmotiven der intrazellulären Domäne von Flt3 (oder ihrem nicht phosphorylierten Gegenstück; Sequenz siehe [12], [13]) entsprechen, wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers auf UltraLink-Kügelchen (Thermo Scientific) immobilisiert. Aufschlämmung von immobilisiertem Peptid (50 &mgr;l) wurde bei 4°C für 2 Stunden mit SLAP-transfizierten COS-1-Zelllysaten inkubiert. Peptidgebundene Proteine ​​wurden dann für Western-Blotting verarbeitet.

Immunpräzipitation und Western Blotting
Nach der Stimulation wurden die Zellen einmal mit eiskaltem PBS gewaschen und in 1 % Triton X100 Lysepuffer lysiert. Die Lysate wurden dann für die Immunpräzipitation und das Western-Blotting wie zuvor beschrieben verarbeitet [14]. Der Immunnachweis wurde durch verstärkte Chemolumineszenz unter Verwendung von chemolumineszierendem Meerrettichperoxidase-Substrat von Immobilon Western (Millipore Corporation, Milford, MA, USA) und einer CCD-Kamera (LAS-3000, Fujifilm, Tokio, Japan) durchgeführt. Die Signalintensität wurde durch Multi-Gauge-Software (Fujifilm) quantifiziert.

Kolokalisierungsstudie
Mit Flt3 und SLAP-FLAG transfizierte Ba/F3-Zellen wurden nach dem Hungern für 5 Minuten mit FL stimuliert oder nicht. Die Zellen wurden dann fixiert, permeabilisiert und blockiert, gefolgt von einer Färbung mit Fluorophor-konjugiertem Anti-Flt3 und Anti-FLAG. Kerne wurden mit DAPI gefärbt. Die Lokalisierung von Flt3 und SLAP wurde mit dem Carl Zeiss LSM 710 Laser Scanning Microscope visualisiert. Die Kolokalisierung wurde mit CoLocalizer Pro 2.7.1 gemessen.

Rezeptorabbau
Die Zellen wurden mit 100 &mgr;g/ml Cycloheximid für 4 Stunden bei 37°C in RPMI-1640-Medium ohne Serum und Zytokine inkubiert. Die Zellen wurden dann mit oder ohne 100 ng/ml FL für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von Lyse und Immunpräzipitation mit einem Anti-Flt3-Antikörper. Die Proben wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting bewertet. Die Signalintensität wurde durch Multi-Gauge-Software (Fujifilm) quantifiziert.

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC040793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC040793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC050793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC050793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNCAP0793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNCAP0793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNCB0793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNCB0793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNCP0793-250 Biotium 250uL 459.6 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNCR0793-250 Biotium 250uL 459.6 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC940793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC940793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNCA0793-250 Biotium 250uL 459.6 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC810793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC810793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNUB0793-100 Biotium 100uL 250.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNUB0793-500 Biotium 500uL 549.6 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNCH0793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNCH0793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC880793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC880793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC680793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC680793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC470793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC470793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC400793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC400793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC430793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC430793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC550793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC550793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC610793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC610793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC800793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC800793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC700793-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNC700793-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY793) Antibody

BNUM0793-50 Biotium 50uL 474 EUR

Anti-Phosphotyrosine Antibody Clone PY793, Unconjugated-100ug

MSM2-793-P1 EnQuireBio 100ug 513.6 EUR

Phosphotyrosine antibody

70R-10685 Fitzgerald 1 ml 447.6 EUR

Phosphotyrosine Antibody

49532-100ul SAB 100ul 399.6 EUR

Phosphotyrosine Antibody

49532-50ul SAB 50ul 286.8 EUR

Phosphotyrosine antibody

20C-CR1333RP Fitzgerald 100 ug 159.6 EUR

Phosphotyrosine antibody

20-B9095RD00-D0 Fitzgerald 1 mg 289.2 EUR

Phosphotyrosine antibody

20-B9096RD00-D0 Fitzgerald 1 mg 289.2 EUR

Phosphotyrosine antibody

20R-PR018 Fitzgerald 100 ug 1008 EUR

Phosphotyrosine Antibody

20-abx159644 Abbexa
  • 326.40 EUR
  • 276.00 EUR
  • 100 ug
  • 50 ug

Phosphotyrosine Antibody

abx140243-01mg Abbexa 0.1 mg 477.6 EUR

Phosphotyrosine Antibody

20-abx134716 Abbexa
  • 427.20 EUR
  • 644.40 EUR
  • 260.40 EUR
  • 100 ul
  • 200 ul
  • 30 ul

Phosphotyrosine Antibody

abx440053-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx442582-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx442863-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx443143-100ug Abbexa 100 ug 661.2 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx443423-100ug Abbexa 100 ug 661.2 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx443704-100ug Abbexa 100 ug 693.6 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx443985-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx444266-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx444547-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx444899-100ug Abbexa 100 ug 610.8 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx448448-400ul Abbexa 400 ul 644.4 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx440334-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx440615-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx440896-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx441177-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx441458-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx441739-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx442020-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

abx442301-100ug Abbexa 100 ug 678 EUR

Phosphotyrosine Antibody

R20195-100UG NSJ Bioreagents 100ug 439 EUR

Phosphotyrosine Antibody

F54032-0.1ML NSJ Bioreagents 0.1 ml 389 EUR

Phosphotyrosine Monoclonal Antibody

ABM40204-003ml Abbkine 0.03ml 189.6 EUR

Phosphotyrosine Monoclonal Antibody

ABM40204-01ml Abbkine 0.1ml 346.8 EUR

Phosphotyrosine Monoclonal Antibody

ABM40204-02ml Abbkine 0.2ml 496.8 EUR

Phosphotyrosine (pTyr) Antibody

abx414243-05mg Abbexa 0.5 mg 794.4 EUR

Phosphotyrosine Antibody (APC)

abx448425-400ul Abbexa 400 ul 710.4 EUR

Phosphotyrosine Antibody (FITC)

abx448426-400ul Abbexa 400 ul 693.6 EUR

Phosphotyrosine Antibody (PerCP)

abx448428-400ul Abbexa 400 ul 710.4 EUR

Phosphotyrosine Antibody (RPE)

abx448429-400ul Abbexa 400 ul 710.4 EUR

Phosphotyrosine Antibody (Streptavidin)

abx448430-400ul Abbexa 400 ul 710.4 EUR

Phosphotyrosine Antibody (Biotin)

abx448449-400ul Abbexa 400 ul 727.2 EUR

Phosphotyrosine Antibody (HRP)

abx448450-400ul Abbexa 400 ul 727.2 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNC040232-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNC040232-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNC050232-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNC050232-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNCAP0232-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNCAP0232-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNCB0232-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNCB0232-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNCP0232-250 Biotium 250uL 459.6 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNCR0232-250 Biotium 250uL 459.6 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNC940232-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNC940232-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNCA0232-250 Biotium 250uL 459.6 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNC810232-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNC810232-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNUB0232-100 Biotium 100uL 250.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNUB0232-500 Biotium 500uL 549.6 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNCH0232-100 Biotium 100uL 238.8 EUR

Phosphotyrosine(PY20) Antibody

BNCH0232-500 Biotium 500uL 652.8 EUR

Statistische Analyse
Gegebenenfalls wurden die Daten als Mittelwert ± SE ausgedrückt. Die Daten wurden durch einfache ANOVA mit Posttests von Bonferroni oder Dunnett unter Verwendung von GraphPad Prism 5.0 analysiert. Die statistische Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt.

Schreibe einen Kommentar

Deine E-Mail-Adresse wird nicht veröffentlicht. Erforderliche Felder sind mit * markiert