Monoklonaler Antikörper für den KDEL-Rezeptor

ADP-Ribosylierungsfaktor 1 (ARF1) ist ein Schlüsselregulator des Transports im sekretorischen System. Wie bei allen kleinen GTPasen erfordert die Deaktivierung von ARF1 ein GTPase-aktivierendes Protein (GAP), das die Hydrolyse von GTP zu GDP auf ARF1 fördert. Die Struktur-Funktions-Analyse eines GAP für ARF1 zeigte, dass seine Aktivität in vivo nicht nur eine Domäne erfordert, die die Hydrolyse von GTP auf ARF1 katalysiert, sondern auch eine nicht-katalytische Domäne.

In dieser Studie zeigen wir, dass die nicht-katalytische Domäne von GAP für seine Rekrutierung aus dem Zytosol zu Membranen erforderlich ist und dass diese Domäne die Wechselwirkung von GAP mit dem Transmembran-KDEL-Rezeptor vermittelt.

  • Die Blockierung seiner Wechselwirkung mit dem KDEL-Rezeptor verlässt das GAP-Zytosol und verhindert die Deaktivierung von Golgi-lokalisiertem ARF1 in vivo. Somit deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der KDEL-Rezeptor eine entscheidende Rolle bei der Funktion von GAP spielt, indem er seine Rekrutierung aus dem Zytosol zu den Membranen reguliert, wo er dann auf sein membranbeschränktes Ziel, die GTP-gebundene Form von ARF1, einwirken kann.
  • Der Transport zwischen intrazellulären Membrankompartimenten wird durch membrangebundene Träger erreicht, die durch die Rekrutierung von zytosolischen Hüllproteinen auf Membranen gebildet werden.
  • Bei der Lieferung an ein Zielkompartiment müssen Hüllproteine ​​an das Zytosol abgegeben werden, bevor Transportträger mit dem Kompartiment fusionieren können. Mitglieder der ADP-Ribosylierungsfaktor (ARF)1-Familie kleiner GTPasen regulieren die Rekrutierung von Hüllproteinen.
  • Die Bindung von GTP aktiviert ARF1 und stabilisiert seine Assoziation mit Zielmembranen. Im frühen sekretorischen System führt die stabilisierte Assoziation von ARF1 mit Golgi-Membranen zur Rekrutierung der zytosolischen COPI-Hüllproteine. Anschließend deaktiviert die Hydrolyse seines gebundenen GTP zu GDP ARF1. Als Ergebnis werden sowohl ARF1 als auch COPI von den Membranen ins Zytosol freigesetzt (1, 2, 3).

Wie alle kleinen GTPasen erfordert die Umwandlung von ARF1 zwischen seinen beiden Zuständen eine Katalyse, die durch einen Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF) erreicht wird, der den Austausch von GDP gegen GTP verstärkt, und ein GTPase-aktivierendes Protein (GAP), das die Hydrolyse von GTP zu GDP fördert .

Mehrere GEFs (4, 5, 6, 7) und GAPs (8, 9, 10) für ARF1 wurden basierend auf ihrer Fähigkeit identifiziert, den GTPase-Zyklus von ARF1 in vitro zu katalysieren. Die Rolle dieser Regulatoren in vivo muss jedoch in vielen Fällen noch ermittelt werden, da ihre Fähigkeit, sich in denselben subzellulären Kompartimenten wie ARF1 zu lokalisieren und seine Effektorfunktionen in diesen Kompartimenten zu regulieren, ungewiss bleibt. Ein GAP für ARF1 wurde identifiziert und es wurde gezeigt, dass er am Golgi-Komplex lokalisiert ist (8). Wenn es in Säugerzellen überexprimiert wird, induziert dieses ARF1-GAP einen Phänotyp, der mit der Deaktivierung von Golgi-lokalisiertem ARF1 übereinstimmt (11). Dieser Phänotyp manifestiert sich durch die Freisetzung von COPI aus dem Golgi-Komplex und die Umverteilung des gesamten Golgi-Komplexes zum ER.

Unter Verwendung dieses Phänotyps als In-vivo-Assay haben wir mindestens zwei funktionelle Domänen in ARF1 GAP (12) identifiziert. Die katalytische Domäne befindet sich im Aminoteil des Proteins, da eine verkürzte Form von GAP, die ihre ersten 257 Aminosäuren enthält, im In-vitro-GAP-Assay vollständig aktiv ist. Diese Verkürzungsmutante zeigt jedoch eine verringerte Aktivität im In-vivo-Assay der ARF1-Deaktivierung. Daher ist für die GAP-Aktivität auf ARF1 in vivo auch eine nichtkatalytische Domäne erforderlich, die Teile des Carboxylterminus von GAP umfasst. Da die GTP-gebundene Form von ARF1 auf Membranen beschränkt ist (13, 14, 15, 16) und zytosolisches GAP zu Membranen rekrutiert werden muss, um auf sein Ziel einzuwirken, besteht eine Möglichkeit darin, dass die nicht-katalytische Domäne von GAP wichtig sein könnte Vermittlung dieser Rekrutierung.

Relevant für diese Möglichkeit hatten wir zuvor gezeigt, dass der Transmembran-KDEL-Rezeptor mit ARF1 GAP assoziiert (11). Der KDEL-Rezeptor wurde ursprünglich so definiert, dass er eine große Klasse von löslichen ER-Proteinen mit einem Carboxyl-terminalen Motiv von Lysin-Aspartat-Glutamat-Leucin (KDEL) erkennt (17, 18). Diese KDEL-Proteine ​​erfüllen im ER wesentliche Funktionen im Zusammenhang mit der Proteinfaltung und -assemblierung (19). Wann immer diese Proteine ​​aus dem ER austreten und den Golgi-Komplex erreichen, werden sie durch den KDEL-Rezeptor (20) zum ER zurückgeholt. Die Möglichkeit, dass der KDEL-Rezeptor nicht nur KDEL-Proteine ​​abruft, sondern auch den Transport in den frühen Sekretionswegen reguliert, wurde ursprünglich durch Beobachtungen von Hefemutanten mit deletierten KDEL-Rezeptoren nahegelegt.

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Diese Mutanten konnten nicht nur keine KDEL-Proteine ​​abrufen, sondern hatten auch einen fehlregulierten Transport durch den Golgi-Komplex (17). Bei der Aufklärung, wie der KDEL-Rezeptor den Transport reguliert, zeigten wir, dass eine Überexpression des KDEL-Rezeptors einen Phänotyp der ARF1-Deaktivierung durch Interaktion mit ARF1 GAP induziert (11). Darüber hinaus reguliert die Ligandenbindung durch den KDEL-Rezeptor seine Wechselwirkung mit GAP (21). Somit scheint die Regulation des Transports durch den KDEL-Rezeptor vielen Signaltransduktionsvorgängen grundsätzlich ähnlich zu sein, bei denen Membranrezeptoren entweder durch eine GAP oder GEF von kleinen Schlüssel-GTPasen wirken, um verschiedene zelluläre Ereignisse zu regulieren (22).

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