Monoklonaler Anti-Human-CD5-Antikörper PE-konjugiert, durchflussvalidiert

Die rationale Entwicklung von CD5-gerichteten biepitopen CARs mit vollständig humanen Nur-Schwerketten-Antigenerkennungsdomänen

T-Zell-Malignome sind eine Gruppe hämatologischer Krebsarten mit hohen Rezidiv- und Mortalitätsraten. CD5 wird in etwa 85 % der malignen T-Zell-Erkrankungen stark exprimiert, obwohl die normale Expression von CD5 auf Thymozyten, T-Zellen und B1-Zellen beschränkt ist. Die CD5-Expression auf chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen führt jedoch zu CAR-T-Zell-Brudermord. Sobald diese Einschränkung überwunden ist, könnte die auf CD5 gerichtete CAR-T-Therapie eine attraktive Strategie zur Behandlung von malignen T-Zell-Erkrankungen sein.

Hier berichten wir über die Auswahl neuartiger CD5-gerichteter vollständig humaner Schwerketten-Variablendomänen (FHVH) für die Entwicklung eines biepitopen CAR mit der Bezeichnung FHVH3/VH1, das FHVH1 und FHVH3 enthält und für die validiert wurde, dass sie an verschiedene Epitope des CD5-Antigens binden . Um Brudermord in CD5-CAR-T-Zellen zu verhindern, haben wir die Herstellungsverfahren eines CRISPR-Cas9-basierten CD5-Knockouts (CD5KO) und die lentivirale Transduktion von Anti-CD5-CAR optimiert. Funktionelle In-vitro- und In-vivo-Vergleiche zeigten, dass biepitope CD5KO-FHVH3/VH1-CAR-T-Zellen eine verbesserte und länger anhaltende Wirksamkeit zeigten; erzeugte mäßige Zytokin-Sekretion; zeigte ähnliche Spezifitätsprofile wie entweder FHVH1, FHVH3 oder das klinisch getestete H65; und eignet sich daher zur Weiterentwicklung.

Einführung

In den letzten Jahren wurden Fortschritte in der Therapie mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR-T) erzielt, um maligne B-Zell-Erkrankungen anzugreifen, eine Remission zu induzieren und das langfristige rezidivfreie Überleben bei Patienten mit B-Zell-Leukämie und Lymphom zu verbessern.1, 2 , 3, 4, 5 Die Gesamtprognose von refraktären oder rezidivierenden (r/r) T-Zell-Malignomen ist jedoch im Vergleich zu B-Zell-Malignomen viel schlechter, und Salvage-Chemotherapieschemata bleiben die beste Behandlung für Patienten mit r/r T-Zell-Leukämie oder Lymphom.6, 7, 8 Daher ist es unerlässlich, neuartige wirksame CAR-T-Zelltherapien zur Bekämpfung von malignen T-Zell-Erkrankungen zu entwickeln.

• CD5 wird konstitutiv auf normalen T-Zellen exprimiert und ist in etwa 85 % der malignen T-Zell-Erkrankungen vorhanden.9 Es enthält drei Cystein-reiche Scavenger-Rezeptor-Domänen (SRCR),10, 11, 12 die als inhibitorische Regulatoren sowohl des T-Zell-Rezeptors (TCR ) und B-Zell-Rezeptor (BCR)-Signalisierung und dienen als Ziel für evolutionäre immuntherapeutische Strategien gegen maligne T-Zell-Erkrankungen.13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 Darüber hinaus wird CD5 auch häufig in einigen bösartigen wobei die Expression in normalen Geweben auf Thymozyten, T-Zellen und eine kleine Subpopulation von B-Zellen (B1-Zellen) beschränkt ist.20,21
• Die Daten aus einer klinischen Phase-I-Studie , die vom Baylor College of Medicine durchgeführt wurde, haben dies gezeigt CAR-T-Zellen, die ein von der Maus stammendes einzelkettiges variables Fragment (scFv) H65 enthielten, das auf CD5 abzielt, waren sicher und hatten eine Anti-Tumor-Aktivität bei Patienten mit r/r-T-Zell-Malignomen.9 Die Patienten, die eine objektive Reaktion nach Infusion ohne Erhalt geplant hämatopoetische Stammzelltransplantation mit ihrer latenten CD5+-Malignität nach einigen Wochen einen Rückfall erlitten.9 Verbesserungen der Wirksamkeit und Persistenz von CD5-gerichteten CAR-T-Zelltherapien für maligne T-Zell-Erkrankungen sind eindeutig dringend erforderlich.
• Die begrenzte Lebensdauer von CAR-T-Zellen bei Patienten kann mit dem Brudermord von Anti-CD5-CAR-T-Zellen und humanen Anti-Maus-Antikörperantworten zusammenhängen, wohingegen die Anwendung von CD5-Knockout (CD5KO) vollständig humanem (FH) Antikörper-abgeleitetem CAR -T-Zellen können das Überleben und die optimale Funktion von CAR-T-Zellen verlängern.22, 23, 24, 25
• Hier berichten wir über die Auswahl neuer variabler (VH) Domänen der schweren Kette von FH und die rationale Entwicklung einer Fratrizid-resistenten, CD5-gerichteten biepitopen CAR-T-Therapie. Unter Verwendung einer hochwertigen FH-Phagen-Display-Bibliothek, die intern entwickelt wurde und 8,32 × 1010 VH-Domänen enthält, erhielten wir durch Panning, primäres Screening und Identifizierung einige VHs, die spezifisch an rekombinantes CD5-Protein und Zelloberflächen-CD5 binden.
• Wir stellten die Hypothese auf, dass die gleichzeitige Verwendung von VH-Domänen, die auf verschiedene Epitope abzielen, möglicherweise die Funktion von CAR-T-Zellen verbessern und das Risiko eines Tumorausbruchs aufgrund einer Antigenmutation minimieren könnte. Daher wurden durch kompetitive Bindungs-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)-Analyse FHVH1 und FHVH3, zwei VH-Domänen, die an unterschiedliche Epitope von CD5 binden, identifiziert.
• Als nächstes haben wir zur Verlängerung der CAR-T-Zellpersistenz eine 4-1BB co-stimulatorische Domäne im Design des CAR-Konstrukts angewendet, von der berichtet wurde, dass sie die Fähigkeit besitzt, das Überleben von CAR-T-Zellen zu fördern26,27 und anschließend den CD5-Knockout optimiert und lentivirale Transduktionsschritte zur erfolgreichen Generierung von Anti-CD5-CAR-T-Zellen, die Brudermord widerstehen. Darüber hinaus wurden die Funktionen der Degranulation, Zytotoxizität, Zytokinfreisetzung, Expansion und Persistenz von H65-, FHVH1-, FHVH3- und biepitopen FHVH3/VH1-CAR-T-Zellen in vitro und in vivo bestätigt.
• FHVH3/VH1 CAR-T-Zellen zeigten starke und länger anhaltende Wirksamkeits- und Spezifitätsprofile, die denen von klinisch verwendetem H65 ähneln. Dieses biepitope CAR wird derzeit für die weitere Evaluierung und Entwicklung vorbereitet.

Ergebnisse

Screening und Selektion von FH-CD5-spezifischen VH-Domänen

Ein Diagramm des Screening- und Auswahlverfahrens ist in Abbildung 1Adargestellt. Die VH-Domänen wurden aus einer Phagen-Display-Bibliothek, die sowohl naive als auch synthetische menschliche VH-Domänen umfasste, durch drei Protein-Panning-Runden nach der Anreicherung gescreent (Tabelle S1). Insgesamt 92 monoklonale Antikörper wurden für den Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ausgewählt und unter Verwendung von CD5+ Jurkat- und CD5− Raji-Zellen für das FACS-Screening validiert, von denen 38 Klone spezifisch an das CD5-Protein banden, ohne an andere Kontrollproteine ​​zu binden, und die repräsentative Klone sind in Abbildung 1B gezeigt. Nach der Sequenzierung wurden 29 einzigartige Klone identifiziert. Die Bindungsspezifität dieser 29 Klone mit zusätzlichen CD5+/–-Zelllinien wurde weiter durch FACS-Analyse charakterisiert.

Von diesen wurde bestätigt, dass vier Klone (FHVH1–4) an eine andere vom Menschen stammende CD5+-Zelllinie (CCRF-CEM; Abbildung 1C) binden. Um ihre Bindungsaffinitäten zum CD5-Antigen weiter zu messen, wurden diese VH-Klone zusammen mit H65 im Format VH/scFv-Human-Immunglobulin-Fc-Fragment (hFc) oder VH/scFv-Kaninchen-Immunglobulin-Fc-Fragment (rFc) exprimiert und gereinigt. Die Bindungsaffinität wurde unter Verwendung des Octet96e-Systems bestimmt. FHVH1 (KD = 1,63 × 10 –9 M), FHVH2 (KD = 8,32 × 10 –9 M) und FHVH3 (KD = 1,39 × 10 –9 M) zeigten im Vergleich zu H65 ( KD = 6,53 × 10 –10 M), obwohl FHVH4 (KD = 2,47 × 10 –8 M) eine wesentlich niedrigere Affinität als die obigen Klone aufwies.