CD63(MX-49.129.5)-Antikörper

Glioblastome sind die häufigsten primären Hirntumoren bei Erwachsenen und gehören zu den tödlichsten Krebsarten. Trotz aggressiver Behandlung, bestehend aus Operation, Bestrahlung und Temozolomid, bleiben Glioblastome unheilbar [1]. Eine vollständige chirurgische Resektion ist kaum zu erreichen, und es ist bekannt, dass Glioblastome teilweise therapieresistent sind, was möglicherweise die schlechte Prognose der Patienten erklärt. Insbesondere die unreifen tumorinitiierenden Zellen – die vermeintlichen Tumorstammzellen – können die scheinbare Resistenz gegenüber Strahlen- und Chemotherapie erklären [2,3,4,5].

Die Mechanismen hinter dieser Resistenz sind komplex mit mehreren beitragenden Faktoren. Einer dieser Faktoren könnte der Gewebeinhibitor der Metalloproteinase 1 (TIMP-1) sein, da TIMP-1 an verschiedenen zellulären Überlebensfunktionen beteiligt ist [6,7,8] und mit einer verminderten Chemosensitivität bei Brust- und Darmkrebs in Verbindung gebracht wurde [9 ,10,11,12,13].

Mithilfe der Immunhistochemie haben wir zuvor gezeigt, dass die TIMP-1-Spiegel mit dem Malignitätsgrad der Weltgesundheitsorganisation (WHO) bei Patienten mit Astrozytom ansteigen und dass niedrige TIMP-1-Spiegel im Vergleich zu moderaten oder hohen TIMP-1-Spiegeln ein signifikant längeres Gesamtüberleben vorhersagen Patienten mit Glioblastom [14].

In ähnlicher Weise wurde berichtet, dass hohe TIMP-1-Spiegel mit einer schlechten Prognose bei Dickdarm- [15,16,17,18], Brust- [19,20,21,22,23], Magen- [24,25] und Eierstockkrebs korrelieren [ 26, 27].

• Junget al. zeigten, dass TIMP-1 mit dem Zelloberflächenprotein CD63, auch bekannt als Lysosomal Associated Membrane Protein 3 (LAMP-3), und Integrin β1 auf der Oberfläche der Brustzelllinie MCF10 interagiert, was darauf hindeutet, dass eine chemoinduzierte Apoptose verhindert wurde [28].
• dass die Wechselwirkung zwischen TIMP-1 und CD63 zur Chemoresistenz beitragen kann. CD63 ist ein Tetraspanin, das mit verschiedenen Proteinen wie Integrinen und Tyrosinkinasen interagiert, die an der Regulierung intrazellulärer Signaltransduktionswege beteiligt sind, die die Zelladhäsion, -motilität und das Überleben steuern [28,29,30,31].
• Das CD63-Protein ist auch in Exosomen angereichert [32]. Berichten zufolge tragen Exosomen auch bei Gliomen erheblich zur interzellulären Kommunikation bei [32,33,34,35] und spielen möglicherweise eine Rolle bei der Chemoresistenz bei Krebs [35, 36]. Nur wenige Studien haben das Vorhandensein von CD63 in Gliomen untersucht [37, 38].
• Unter Verwendung von Gewebe-Mikroarrays haben Rorive et al. fanden die höchste CD63-Expression in pilozytischen Astrozytomen, gefolgt von Glioblastomen und anaplastischen Astrozytomen mit der niedrigsten Expression in diffusen Astrozytomen [37]. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass CD63 mit TIMP-4 interagiert, und die Co-Expression von CD63/TIMP-4 war mit einem schlechteren Ergebnis bei Glioblastompatienten verbunden. Im Gegensatz dazu haben Kase et al. fanden, dass hohe Mengen an CD63+ Immunzellen mit einem besseren Überleben nach postoperativer Strahlentherapie bei Patienten mit Glioblastom korrelierten [38].
• Ob TIMP-1 und CD63 auf der Oberfläche von Glioblastomzellen interagieren können, ist bisher unbekannt. Eine Studie von Lee et al. zeigten, dass das von Gliomen stammende TIMP-1 die Migration von neuralen Stammzellen zum Tumor fördern kann, indem es mit dem von den Stammzellen exprimierten CD63 interagiert.
• Ähnliche Ergebnisse wurden für CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) berichtet, wo CD63 zusammen mit Integrin β1 als ein Rezeptorkomplex für TIMP-1 identifiziert wurde, der die Zelladhäsion und -migration [39] sowie die klonogene Expansion und das Überleben in HSPCs [40] vermittelt. . Insgesamt legen diese Ergebnisse eine enge Zusammenarbeit zwischen TIMP-1 und CD63 nahe [41].

Das Ziel dieser Studie war es, die prognostische Wirkung von CD63 allein und in Kombination mit TIMP-1 zu bewerten, indem eine Immunhistochemie an einer Kohorte von 111 Astrozytomen durchgeführt wurde, die zuvor für die Bewertung des prognostischen Potenzials von TIMP-1 beschrieben und verwendet wurden [14]. Co-Expressionsmuster von TIMP-1 und CD63 wurden unter Verwendung von Doppel-Immunfluoreszenz, Proximity-Ligation-Assay und Co-Immunpräzipitation untersucht. Die mögliche Co-Expression von CD63 und dem Mikroglia/Makrophagen-Marker ionisiertes Calcium-bindendes Adaptermolekül 1 (Iba1) wurde mittels Doppel-Immunfluoreszenz untersucht. Um den Zusammenhang zwischen TIMP-1 und Krebsstamm zu untersuchen, wurden doppelte Immunfluoreszenzfärbungen unter Verwendung der geschlechtsbestimmenden Region Y-Box 2 (Sox2) [42, 43] und CD133 [5, 44,45,46,47] als Marker von durchgeführt tumorstammähnliche Zellen.

Methoden

Patientengewebe

Die immunhistochemische Expression von CD63 wurde in archiviertem Tumormaterial von 111 Patienten untersucht, die sich zwischen 1995 und 2005 am Universitätskrankenhaus Odense, Dänemark, einer ersten Operation wegen eines primären Glioms unterzogen hatten. Keiner der Patienten war vor der Kraniotomie behandelt worden. Das Patientenkollektiv wurde in früheren Studien beschrieben [14, 44, 48, 49]. Alle Tumoren wurden gemäß der Weltgesundheitsklassifikation (WHO) 2016 neu klassifiziert [1]. Die Kohorte umfasste 23 diffuse Astrozytome, 14 anaplastische Astrozytome und 74 Glioblastome.
In-vitro-Kultivierung von Sphäroiden
Die In-vitro-Kultivierung von fünf verschiedenen, von Patienten stammenden Sphäroiden wurde mit frischem Tumorgewebe von fünf Patienten durchgeführt, die sich von September 2007 bis Mai 2008 in der Abteilung für Neurochirurgie des Universitätskrankenhauses Odense, Dänemark, einer ersten Operation wegen Astrozytom WHO-Grad III und IV unterzogen hatten. Von allen fünf Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Das Tumorgewebe wurde wie zuvor beschrieben verarbeitet und kultiviert [50]. Kurz gesagt, Tumorgewebe wurde mit zwei Skalpellen manuell in kleine Fragmente von 200–400 μm geschnitten. Die Tumorfragmente wurden 10–15 Tage in mit 0,75 % Agar beschichteten Kulturflaschen von 75 cm2 kultiviert, die 20 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (Sigma Aldrich, USA) enthielten, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (Fisher Scientific, USA), 2 %. Glutamin (Cambrex, USA), 4 % nicht essentielle Aminosäuren (Cambrex) und 2 % Penicillin/Streptomycin (Cambrex) bis zur Bildung von Sphäroiden in einem Standard-Gewebekulturinkubator (95 % Feuchtigkeit, 95 % Luft und 5 % CO2). Kommerzielle, von der U87MG-Zelllinie abgeleitete Sphäroide wurden unter den gleichen Bedingungen kultiviert, bis sie eine Größe von 200–400 μm erreichten. Sphäroide wurden dann in 4% neutral gepuffertem Formaldehyd für 24 h fixiert und in Paraffin eingebettet. Anschließend wurden die Konservierungs- und Expressionsmuster von TIMP-1, CD63 und den stammbezogenen Markern CD133 und Sox2 mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie untersucht.

Immunhistochemie
In Formaldehyd fixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe wurde auf einem Mikrotom in drei μm-Schnitte geschnitten und routinemäßig mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, um repräsentative Tumorregionen zu definieren. Für die immunhistochemische Färbung mit CD63 wurden die Paraffinschnitte dann entparaffiniert und die endogene Peroxidaseaktivität gequencht, gefolgt von einer hitzeinduzierten Epitopwiedergewinnung (HIER) in TRS-Puffer (Dako, Dänemark). Anschließend wurden die Schnitte für 60 min mit einem CD63 monoklonalen Antikörper (MX-49.129.5, Santa Cruz, 1 + 1000, USA) inkubiert. Der Antigen-Antikörper-Komplex wurde mit Anti-Maus-EnVision (Dako) nachgewiesen und mit Diaminobenzidin (DAB) als Chromogen sichtbar gemacht. Abschließend wurden die Schnitte mit Mayers Hämatoxylin gegengefärbt.

Die immunhistochemische Färbung auf Mutationen in der Isocitratdehydrogenase 1 (IDH-1) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [51, 52]. Für diffuse und anaplastische Astrozytome, die gemäß Immunhistochemie IDH-1-Wildtyp waren, wurde eine Sequenzierung der nächsten Generation unter Verwendung des 20-Gen-Panels durchgeführt, wie von Zacher et al. [53].

Auswertung der CD63-Färbung
Die immunhistochemischen Scores basierten auf dem durchschnittlichen Prozentsatz an CD63+-Tumorzellen, CD63+-Tumorblutgefäßen sowie der Gesamtfärbungsintensität sowohl für Tumorzellen als auch für Blutgefäße. Nekrotische Bereiche sowie Invasionszonen wurden ausgeschlossen. Um einen CD63-Gesamtwert für jeden Patienten zu erhalten, wurden die Werte für die positive Färbung und Intensität sowohl der Tumorzellen als auch der Blutgefäße summiert, was zu einem maximalen CD63-Gesamtwert von 12 führte.

Zum Vergleich mit dem Gesamtüberleben der Patienten wurden die Tumore in drei Gruppen eingeteilt entsprechend einer niedrigen (Gesamt-CD63-Werte 0–6), mittleren (Gesamt-CD63-Werte 7–8) und hohen (Gesamt-CD63-Werte 9–12) CD63-Expression. Das Scoring-System und der Scoring-Prozess wurden unter Anleitung eines erfahrenen Neuropathologen entwickelt und durchgeführt.